摘要:：本实验通过SDS高盐法(常规法)、SDS高盐法（改良法）和BIOMIGA试剂盒对土壤微生物总DNA进行提取，对比DNA提取液的OD260/OD230、OD260/OD280的值、颜色、PCR效果图以及提取时间，确认总DNA提取液的质量以确定最合适的方法。目的是为最终的PCR-DGGE分析做准备工作。最快的方法是试剂盒法，但不节省成本；SDS高盐法（改良法）是节省成本且适合提取土壤微生物总DNA方法;。

关键词：DNA，土壤微生物，SDS，DNA提取试剂盒，PCR

综述

土壤是微生物最喜欢的场所，因为土壤含有各种各样丰富的营养物质和适合微生物生长的环境。土壤微生物在生物地球化学循环中扮演着非常重要的角色,对地表生态系统乃至全球都存在重要影响[1]。传统土壤生态系统中微生物群落多样性及结构大多是将微生物进行分离培养,通过一般的生物化学性状,或者特定的表型来分析。随着人们对土壤微生物研究的深入,发现常规培养方法只能反映极少数微生物的信息,不能充分了解土壤微生物生态功能,很难全面地估价微生物群落多样性,也埋没了大量具有很大应用价值的微生物资源[2]。

   土壤生态系统中的各种生物相互作用,形成复杂的土壤食物网,正是这些土壤生物的活动,使土壤生态系统具有各种各样的生态服务功能。由于土壤中微生物数量庞大,作用复杂,在土壤生物的研究中占据重要地位。土壤微生物包括原核微生物如细菌、蓝细菌、放线菌及超显微结构微生物,以及真核生物如真菌、藻类(蓝藻除外)、地衣等[3] (Jenkinson&Ladd,1981)。它们是土壤有机质(C)和土壤养分(N、P等)转化和循环的主要推动力,并参与腐殖质形成等生化过程,在土壤生态系统中起着非常重要的作用。

近年来由于人口的增加、自然资源的过度开发、环境污染的加剧以及外来物种的入侵,土壤生物多样性受到了强烈的干扰,许多土壤生物类群的多样性降低甚至消失。因而,生物多样性在维持土壤质量、维护陆地生态系统的稳定和健康方面的重要作用日益引起人们的关注。由于土壤微生物的复杂性、土壤本身的多变性和研究方法不完善等原因的限制,以往人们对土壤微生物多样性的研究与动、植物相比远远落后。随着现代生物学尤其是多聚酶链反应(PCR)、核酸测序等分子生物学技术的了解的迅速发展,人们对土壤微生物多样性有了更深入的了解。同时,也有越来越多的学者加入到土壤微生物多样性的研究和保护中来。

影响土壤微生物群落的结构组成和多样性,尤其是其功能多样性的因素有很多种,可大体分成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括植被、土壤类型、温度、水分以及pH值等；人为因素包括农药、施肥以及土壤耕作方式等人类对土壤的管理方式。下面就植被、土壤类型、温度和水分、土壤管理方式几种有代表性的土壤微生物多样性影响因素分别加以阐述。

从研究的层次上划分,土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为三类：遗传多样性、物种多样性和功能多样性。微生物遗传多样性主要通过分子生物学技术,从分子水平上研究土壤微生物多样性；微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性,或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成不同的功能群(function group),通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性[4] (Nannipieri et al.,2003),如对土壤中的产甲烷细菌[5] (Mer&Roger,2001)、固氮菌、根瘤菌、菌根菌等的多样性进行研究；土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与N、P、S等营养元素在土壤中转化相关的功能等,通过分析测定土壤中的一些转化过程,如有机碳、氮矿化速率、土壤氮固持率、硝化作用以及土壤中酶的活性等[6] (Louise et al.,2000)来了解土壤微生物功能, 如对碳源利用功能分析时常用Biolog微平板法。

上述各种方法应用范围不同,精度也不同,各有优缺点。因为环境中大多数微生物处于“存活但不能培养的状态”,因此传统培养法有很大局限性,难以准确研究微生物多样性与其生态功能的关系,精度差；磷脂脂肪酸和脂肪酸甲酯分析方法主要应用于微生物群落动态变化的定量分析,精度一般,虽然能够快速有效地从环境样品中提取大部分脂肪酸,但只能鉴别到属的水平,且受人为因素干扰强烈；Biolog微平板法主要用于异养微生物群落结构多样性的研究,操作快速简便,但精度一般,只能鉴别能在Biolog系统内生长的微生物,其结果受到培养环境的强烈影响；荧光原位杂交用于分析原核微生物的群落结构,精度高,但其应用受到环境样品微生物的生理状态的影响,而且事先要根据已知种属设计探针,不能检测出环境样品中的未知种属；近年来兴起的基于PCR技术的分子生物学研究方法如：RAPD、AFLP、RFLP、SSCP、TGGE、DGGE、RISA等技术已经较为成熟,能鉴定出大部分土壤微生物,且精度高,目前被广泛应用于微生物生态学研究,但这些方法也有不足：(1)每次核酸提取的效率不同,造成结果可重复性差。(2)引物对不同样品的扩增效率不同,引起丰度估计偏差。(3)由于对真核生物核糖体的编码基因及复杂调节机制的研究还不透彻,目前在真核微生物生态学的分析中应用得还较少。因此,将多种技术综合使用可避免由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差,可提供更加全面准确的微生物多样性变化的信息。

随着人们对土壤微生物多样性研究的不断深入,今后的研究工作将集中在如下四个方面：

(1)新技术新方法的应用。随着分子生物学技术的发展,目前的新型技术如DNA芯片技术、环境全基因组测序技术和稳定同位素标记技术等,为土壤微生物多样性研究提供了新的方法,从而能将微生物在基因层面上所发生的变异与环境因子相结合,为土壤微生物多样性功能与生态系统平衡以及各功能群落结构之间关系的研究提供有力的支持。

(2)各种研究方法有机结合。目前对单一方法的研究已经基本成熟,今后有必要加强对各种研究方法的灵活应用,根据各种方法的优缺点将其有机结合,取长补短,消除单一方法的误差,提供更加全面准确的微生物多样性变化信息。

(3)对土壤微生物功能多样性和功能群的研究。土壤微生物功能多样性与土壤功能关系密切,土壤微生物功能多样性是土壤功能的保证,同时也是恢复土壤功能的基础。迄今为止,研究较多的功能多与C、N、S等元素的物质循环和污染物降解过程相关,其他生态过程(例如磷循环)的相关功能研究结果则很少。而微生物多样性研究的一个明显的趋势是将微生物的功能多样性提到了更为突出的位置,在物种尺度之上,更强调功能群的划分,围绕某一土壤生态功能群开展研究正成为土壤生物多样性研究的重要趋势。

(4)将微生物多样性与地区、区域及全球范围的生态学动态分析结合起来。目前人们所能了解的详细的群落多样性信息大部分来自于几类易于研究的群落类型如农田、森林、草地生态系统,岩岸潮间带,温带湖泊等。而对其他类型群落及其相互作用结合起来进行研究,将为我们了解微生物群落结构的普遍模式提供重要帮助。因此,微生物多样性与地区、区域及全球范围的生态学动态分析相结合;扩大微生物多样性研究的群落范围将成为未来微生物多样性研究的热点。

引言

近年来，有关从土壤、水体、海洋沉积中提取ＤＮＡ的方法已得到较好发展[7,8]，1998 年, Handelsman等[9]提出了建立未培养微生物宏基因组文库的设想,把对未培养微生物的研究引入到一个新的层次。而直接提取纯化宏基因组文库是从分子生物学角度研究微生物基因资源的重要途径[10]。目前常用的方法有Porteous等[11]使用加热-酶-异硫氰酸胍裂解细胞提取总DNA；Zhou等[12]使用蛋白酶K和十二烷基硫酸钠（SDS）破解细胞提取总DNA（即SDS高盐抽提法）。这些方法提取的土壤微生物DNA产量高，但杂质也多，其中以腐植酸污染最为严重[7]。如何使所有细胞裂解、充分释放DNA，有效去除杂质，得到可以进行分子生物学操作的高纯度DNA. 鉴于此，人们又尝试许多方法去除腐植酸的影响，如He等[13]使用磷酸盐缓冲液预洗土壤后再提取DNA，Dong等[14]尝试采用Al2（SO4）3去除土壤DNA中的腐植酸，获得良好效果。

本实验通过SDS高盐抽提法（常规法）、SDS高盐抽提法（改良法）和BOIMIGA土壤微生物总DNA试剂盒(Soil gDNA Kit, 货号GD2412-10 50 Pres)提取法的平行比较，使用紫外分光光度计测量DNA纯度，通过琼脂糖凝胶电泳获得DNA提取效果图的初步比较分析，找出更适合于分析土壤微生物多样性的总DNA方法，达到省时间、省金钱和省人力物力最终目的，找出最适合做PCR-DGGE的总DNA提取方法，为研究微生物群落结构和多样性等做好基础准备。

讨论和结论

从土壤中充分裂解微生物细胞，是获得总微生物DNA的关键。微生物细胞与土壤粘附较牢，不易分开，导致靶微生物丢失较多。常用机械破碎方法如玻璃珠振荡法[19]、超声波法[11]、液氮研磨法[20]，或是几种方法的组合来破碎细胞[15]，但过度剧烈的机械破碎法易导致DNA片段的断裂，而在分子生态学研究中，大片段的DNA是用于进一步的分子生物学操作的保证。本实验中避免了剧烈震动，提出的DNA质量较好。

    从以往大量的的文献中可以得知，腐植酸是影响土壤微生物DNA提取的最大障碍，而且成分也有千差万别，可以螯合Mg2+或是和DNA或蛋白质发生共价结合，从而抑制酶的活性，影响后续的实验操作[7]。不同环境中的腐植酸成分不同，所以可以有不同的去除方法。改良法针对土壤，在提取液和抽提液中都使用了CTAB，NaCl/CTAB抽提液还提供了高盐环境。在方法2的抽提过程中，可以看到水相和有机相之间有一层絮状物，很有可能是絮凝的腐植酸类物质。

   方法1提取的DNA总量较大，但方法1提取的DNA纯度非常低(平均值),存在抑制剂成分(如腐殖酸、色素等)， 因而在PCR扩增谱带上看不到相应条带，无法进行后续研究；方法2提取的DNA较好，比方法3的条带亮度和均匀度差了少许，如果PCR时加3μL或4μL的DNA模板，会达到最佳PCR效果，满足分子实验的要求；方法3提取的DNA纯度较高，且可以进行PCR扩增，是适合后续研究的DNA提取方法。如果要缩短实验长度的需求且资金允许的推荐排序为：方法3>方法2>方法1；总体推荐排序:方法2>方法3>方法1，即：SDS高盐法（改良法）>Soil gDNA Kit>SDS高盐法（常规法）。