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摘要:无细胞蛋白表达体系,是一种以细胞提取物为基础进行体外合成蛋白质表达的技术。与传统的体内合成蛋白质技术相比,无细胞蛋白质合成(CFPS)技术能够进行廉价且快速的重组蛋白表达,具有遗传背景简单、反应与操作控制简便等特点。本文利用CFPS技术,在体外合成YycG、YycF蛋白,并用western blot分析检测蛋白的表达。YycFG(也称为WalRK,VicRK,MicAB或TCS02)双组分系统(TCS),是链球菌、芽孢杆菌和葡萄球菌等少数低G+C值革兰氏阳性菌中高度保守的必要双组分调节系统(essential two-component regulatory system,ETCS)。VicR(YycF)为应答调节蛋白(response regulator protein,RR or RRP),VicK(YycG)为膜相关组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK or HPK)。由于其参与调节细胞壁代谢、调节氧化应激与被膜形成、细胞分裂、调节致病力、渗透压调节和维护胞膜完整等重要功能中起关键作用,该系统异常可导致细菌生活力严重下降,甚至死亡,yycF(vicR)非条件突变的细菌一般不能存活,因而成为预防及检测含有该 ETCS 微生物的首要靶标。 . 关键词:细胞提取物;无细胞蛋白质表达系统(CFPS);YycF(vicR); VicK(YycG);western blot
目录 摘要 ABSTRACT 第一章 文献综述-5 1.1引言-5 1.2.1 无细胞蛋白合成技术的发展-5 1.2.2 无细胞蛋白合成技术的原理和优势-6 1.2.3 影响无细胞体系蛋白合成的因素-8 1.2.4无细胞蛋白表达技术关键突破-8 1.3 YycFG双组分信号转导系统-9 1.3.1 双组分调节系统-9 1.3.2 YycFG双组分信号转导系统-10 1.4 Western blotting分析-10 1.4.1 Western-blot的原理及优势-10 1.3.2 影响Western-blot分析结果的因素-11 第二章 实验材料与方法-13 2.1 实验材料-13 2.1.1 实验菌株与质粒-13 2.1.2 主要试剂及规格-13 2.1.3 溶液配制-14 2.1.4实验仪器与设备-17 2.2 实验方法-17 2.2.1 大肠杆菌细胞抽提物的制备-17 2.2.2 质粒提取与检测方法-18 2.2.3 利用无细胞体系合成GFP、yycG、yycF蛋白以及后续检测-19 2.2.4 GFP、 yycG、YycF蛋白Western blot免疫印迹-21 第三章 实验结果及讨论-23 3.1 重组质粒的检测-23 3.2 利用无细胞体系合成GFP蛋白的结果检测-23 3.3 利用无细胞体系合成yycG、yycF蛋白-25 第四章 总结与展望-27 参考文献-28 附录I. pIVEX 2.3d载体图谱-30 致 谢-31 |