大肠杆菌无细胞表达系统表达蛋白的研究.docx

资料分类:科学与工程 上传会员:桑桑老师 更新时间:2019-05-07
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摘要:无细胞蛋白表达体系,是一种以细胞提取物为基础进行体外合成蛋白质表达的技术。与传统的体内合成蛋白质技术相比,无细胞蛋白质合成(CFPS)技术能够进行廉价且快速的重组蛋白表达,具有遗传背景简单、反应与操作控制简便等特点。本文利用CFPS技术,在体外合成YycG、YycF蛋白,并用western blot分析检测蛋白的表达。YycFG(也称为WalRK,VicRK,MicAB或TCS02)双组分系统(TCS),是链球菌、芽孢杆菌和葡萄球菌等少数低G+C值革兰氏阳性菌中高度保守的必要双组分调节系统(essential two-component regulatory system,ETCS)。VicR(YycF)为应答调节蛋白(response regulator protein,RR or RRP),VicK(YycG)为膜相关组氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase,HK or HPK)。由于其参与调节细胞壁代谢、调节氧化应激与被膜形成、细胞分裂、调节致病力、渗透压调节和维护胞膜完整等重要功能中起关键作用,该系统异常可导致细菌生活力严重下降,甚至死亡,yycF(vicR)非条件突变的细菌一般不能存活,因而成为预防及检测含有该 ETCS 微生物的首要靶标。

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关键词:细胞提取物;无细胞蛋白质表达系统(CFPS);YycF(vicR); VicK(YycG);western blot

 

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 文献综述-5

1.1引言-5

1.2.1 无细胞蛋白合成技术的发展-5

1.2.2 无细胞蛋白合成技术的原理和优势-6

1.2.3 影响无细胞体系蛋白合成的因素-8

1.2.4无细胞蛋白表达技术关键突破-8

1.3  YycFG双组分信号转导系统-9

1.3.1 双组分调节系统-9

1.3.2 YycFG双组分信号转导系统-10

1.4 Western blotting分析-10

1.4.1 Western-blot的原理及优势-10

1.3.2 影响Western-blot分析结果的因素-11

第二章 实验材料与方法-13

2.1 实验材料-13

2.1.1 实验菌株与质粒-13

2.1.2 主要试剂及规格-13

2.1.3  溶液配制-14

2.1.4实验仪器与设备-17

2.2  实验方法-17

2.2.1  大肠杆菌细胞抽提物的制备-17

2.2.2  质粒提取与检测方法-18

2.2.3  利用无细胞体系合成GFP、yycG、yycF蛋白以及后续检测-19

2.2.4  GFP、 yycG、YycF蛋白Western blot免疫印迹-21

第三章 实验结果及讨论-23

3.1 重组质粒的检测-23

3.2 利用无细胞体系合成GFP蛋白的结果检测-23

3.3  利用无细胞体系合成yycG、yycF蛋白-25

第四章 总结与展望-27

参考文献-28

附录I.  pIVEX 2.3d载体图谱-30

致    谢-31

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上传会员 桑桑老师 对本文的描述:无细胞合成生物学方法已经能够开发用于表征合成部分或遗传网络的体外原型化环境[7]。开放的环境和降低了复杂度的无细胞系统,也使得可以开发描述无细胞遗传网络性能的定量模型......
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