摘要: L-精氨酸( L-Arginine，简称L-Arg )作为一种条件性必需碱性氨基酸，是合成蛋白质、磷酸肌酸的重要原料，也是生物体内尿素循环的重要中间产物，对生物体维持正常的生理功能有重要作用，广泛应用于食品、化妆品、临床医药等领域。钝齿棒杆菌( Corynebacterium crenatum ) SYPH 5-8为本实验室保藏的一株L-精氨酸高产菌株，其能够利用葡萄糖发酵生产L-精氨酸。本论文选取磷酸烯醇式丙酮酸-丙酮酸-草酰乙酸节点上的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( PEPC )作为研究对象进行了以下研究工作。

敲除C.crenatum SYPH 5-8中编码PEPC的基因ppc，考察ppc基因缺失菌株的生长和L-精氨酸积累情况。实验以C.crenatum SYPH 5-8基因组DNA为模板，利用交叉PCR扩增获得ppc的基因内缺失片段，通过克隆获得重组克隆质粒pMD19-T △ ppc；双酶切重组克隆质粒，将目的片段回收并插入至pK18mobsacB中，构建了用于敲除ppc的质粒pK18mobsacB △ ppc，并实现其成功敲除分别获得重组菌C.crenatum SYPH 5-8 △ ppc ；对重组工程菌进行了初步的发酵产L-精氨酸的研究。ppc基因敲除菌株C.crenatum SYPH5-8 △ ppc L-精氨酸的产量为7.11g/L，与对照菌株C.crenatum SYPH5-8 ( 28.53 g/L )相比，下降了75.08 %; 生物量为15.45 g/L，较对照菌株 ( 25.13 g/L )降低38.51 %，以OAA和α-酮戊二酸为前体合成的氨基酸( Lys、Ile、Arg )含量大幅度下降，以丙酮酸为前体合成的氨基酸( Val、Ala、Leu )含量大幅度上升。由此可得出，PEPC对于C.crenatum SYPH5-8 TCA循环中间代谢物OAA的回补贡献较大，对于菌体的生长和L-Arg的生产具有重要的意义。

增强表达C.crenatum SYPH 5-8中编码PEPC的基因ppc，并对工程菌株的发酵特性进行初步研究。成功构建了携带ppc基因表达质粒pJC-tac-ppc，将pJC-tac-ppc转入E.coli JM109和 C. crenatum SYPA5-8中。对重组菌株C. crenatum SYPA5-8 ppc的发酵特性进行分析，结果显示：C.crenatum SYPH 5-8 ppc的菌体生物量为33.75 g/L,较对照C.crenatum SYPH 5-8-pJC-tac ( 26.25 g/L )提高了28.75 %，L-Arg产量为22.88 g/L，较对照菌株( 26.47 g/L )降低了13.56 g/L，胞外氨基酸中以丙酮酸为前体的氨基酸含量增加，而以草酰乙酸为合成前体的氨基酸含量基本不变。

关键词：L-精氨酸；钝齿棒杆菌；磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( PEPC )；ppc

目录

摘要

ABSTRACT

第1章 绪论-1

1.1 精氨酸的性质及其应用-1

1.1.1 L-精氨酸的理化性质-1

1.1.2 L-精氨酸的生理功能-1

1.1.3 精氨酸的应用-2

1.1.4 L-精氨酸的产业化现状-3

1.2 L-精氨酸高产菌株的研究进展-3

1.2.1 国内外研究进展-3

1.2.2 课题组研究进展-4

1.3 立题依据-5

1.3.1 草酰乙酸回补途径-5

1.3.2 谷氨酸棒杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究进展-5

1.3.3 研究对象的确定-6

1.4 研究内容-6

第2章 材料与方法-9

2.1 菌株及质粒-9

2.2 培养基-9

2.3 主要试剂及工具酶-10

2.3.1 主要试剂-10

2.3.2 工具酶和试剂盒-10

2.3.3 引物-11

2.4 主要的实验仪器-11

2.5 相关试剂的配制-11

2.5.1 坂口试剂法测L-Arg含量中相关试剂的配制-11

2.5.2 DNS法测残糖中相关试剂配制-12

2.5.3 苯酚次氯酸钠法测铵的相关试剂-12

2.5.4 溶菌酶配制-12

2.5.5 蛋白酶K的配制-12

2.5.6 IPTG的配制-12

2.5.7 pH 8.0 TE溶液的配制-12

2.6 培养方法-13

2.6.1 钝齿棒杆菌的培养方法-13

2.6.2 大肠杆菌培养方法-13

2.7 实验方法-13

2.7.1 发酵参数的测定-13

2.7.2 钝齿棒杆菌基因组DNA的提取-14

2.7.3钝齿棒杆菌 △ ppc 3'及 5'基因片段的扩增-15

2.7.4 钝齿棒杆菌ppc 基因片段的扩增-15

2.7.6 割胶回收的方法-16

2.7.7 Crossover PCR的方法-16

2.7.8 PCR产物与T载体的链接-17

2.7.9 大肠杆菌感受态制备及转化-17

2.7.10 大肠杆菌重组质粒DNA的抽提-18

2.7.11 重组质粒的酶切方法-18

2.7.12 基因片段与载体pK18mobsacB、pJC-tac连接-19

2.7.13 钝齿棒杆菌感受态的制备、电击转化与质粒在菌体中的同源重组-19

2.7.14 基因敲除菌株及增强表达菌株的筛选-20

2.7.15 敲除菌株的挑选及验证-20

2.7.16 基因敲除以及增强表达菌株的摇瓶发酵评价-20

第三章 结果与讨论-23

3.1 C.crenatum SYPH 5-8 ppc基因的敲除-23

3.1.1 Δ ppc片段的构建-23

3.1.2 敲除质粒pK18mobsacB ∆ ppc的构建-24

3.1.3 C. crenatum SYPH 5-8 ppc基因缺失菌株的构建-25

3.2 C.crenatum SYPH 5-8 ppc基因的增强表达-27

3.2.1 克隆载体pMD19-T Simple-ppc 的构建-27

3.2.2重组质粒pJC-tac-ppc的构建-28

3.2.3 ppc基因增强表达菌株pJC-tac-ppc的构建-29

3.3 工程菌的发酵评价-29

3.3.1发酵参数的测定-29

3.3.2 发酵液中游离氨基酸的测定-30

3.3.3 菌体PEPC蛋白表达-31

第4章 结论与展望-33

4.1结论-33

4.2 展望-33

参考文献-35

致谢-39