摘要:在现代化工农业社会，为提高农产品的产量，人们大量使用农药，在减轻病虫害的同时也对土壤等生态环境和人类健康造成了一定的损害，其中有机磷农药是最主要的农药之一。因此，有必要找到一种高效、安全的能降解农药的方法来减缓农药的污染。构建能高效分泌农药降解酶的生物重组菌并优化其最适表达条件获得较高酶活力的降解酶是安全而有效的途径。本实验以黄杆菌中存在于质粒pDL2上，能编码有机磷农药水解酶的opd基因为目的基因，以枯草芽孢杆菌WB800为表达宿主菌。通过克隆、转化、酶切、连接等一系列基因技术构建opd基因的广宿主表达载体质粒。先将构建好的表达载体质粒转入大肠杆菌DH5α中，提取pHT43-opd质粒，再用电击转化法将pHT43-opd质粒转入宿主菌枯草芽孢杆菌WB800中进行表达，得到一重组菌WB800/pHT43-opd，测定重组菌表达产物酶的活性并加入诱导剂IPTG进行诱导表达及对其表达条件进行优化，以确定其高效表达的最适表达条件，达到提高有机磷降解酶的表达产量的目的。经测定分析得到的重组酶活力大小，重组菌在诱导前菌液OD600为0.7，IPTG终浓度为1.25 mmol/L的条件下，37℃诱导27小时，酶促反应活力最高，所以这些表达条件为最适表达条件。

关键字  黄杆菌；opd基因；克隆；表达；条件优化

目录

摘要

Abstract

1 绪论-1

1.1 有机磷农药的使用和危害-1

1.1.1 有机磷农药的使用现状-1

1.1.2 有机磷农药的危害-1

1.2 微生物降解有机磷农药-2

1.2.1 微生物降解有机农药的机理-2

1.2.2 微生物修复-3

1.2.3 生物强化技术-3

1.3 影响微生物降解有机磷农药的因素-3

1.3.1 有机磷农药的类型-3

1.3.2 有机磷农药化学结构对微生物降解影响-4

1.3.3 环境因子的影响-4

1.4 农药降解工程菌-4

1.4.1 农药降解酶及酶基因-4

1.4.2 农药降解工程菌的优点-5

1.5 本论文研究的目的及意义-5

2 实验材料、试剂与仪器-7

2.1 菌株与质粒-7

2.2 实验试剂-7

2.3 培养基的配制-8

2.4 需配制试剂的配制-8

2.5 实验仪器-9

3 实验方法-10

3.1 opd基因在枯草芽孢杆菌中表达的载体的构建-10

3.1.1 黄杆菌的保存与活化-10

3.1.2 opd基因的扩增-10

3.1.3 opd基因克隆载体的构建-11

3.1.4 质粒pHT43-opd的构建及表达-13

3.1.5 重组子的筛选-15

3.1.6 酶的活性分析-15

3.2 opd基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达及其表达条件的优化-16

3.2.1 诱导前菌液OD600的优化-16

3.2.2 IPTG诱导浓度的优化-16

3.2.3 诱导温度的优化-16

3.2.4 诱导时间的优化-16

3.2.5 表达条件的优化对酶活力的影响-17

4 结果与分析-18

4.1 重组菌中pHT43-opd质粒的构建-18

4.1.1 黄杆菌的活化-18

4.1.2 opd基因扩增-18

4.1.3 克隆载体的构建-19

4.1.4 opd基因表达载体的构建-21

4.1.5 外源基因在枯草芽孢杆菌中表达及酶活测定-24

4.2 表达条件的优化对酶活力的影响-25

4.2.1 对硝基酚浓度标准曲线-25

4.2.2 诱导前菌液OD600对酶活力的影响-26

4.2.3 IPTG浓度对酶活力的影响-26

4.2.4 诱导温度对酶活力的影响-27

4.2.5 诱导时间对酶活力的影响-27

结论-29

致谢-30

参考文献-31